XXXVI Congreso SETH

XXXVI Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 12 ciones relevantes en SERPINC1. En el grupo de SV la secuencia- ción por nanoporos identificó todas las SV, independientemente de la extensión (desde 193pb a 2 Mb) o tipo (deleción o duplica- ción), definió exactamente la extensión de la SV y estableció la secuencia exacta del punto de ruptura (De la Morena-Barrio B, et al., sometido). Este último aspecto es clave en varios aspectos. Primero, ayu- da a diseñar con precisión los sistemas de verificación que vali- den los resultados obtenidos. En segundo lugar, ayuda a definir el mecanismo implicado. Así, en nuestros casos, la identificación en la mayoría de los casos de secuencias repetitivas en la cercanía del punto de ruptura y la presencia de microhomología (de 3 a 30 pb) en el punto de ruptura muestran la relevancia de las secuen- cias repetitivas (abundantes en SERPINC1) en el desarrollo de estas SV y la implicación de un mecanismo basado en replicación (BIR/MMBIR/FoSTeS) que expliquen la aparición de estas SV. Pero quizás la mayor ventaja desde el punto de vista diagnós- tico es que la secuenciación por nanoporos permite conocer la arquitectura genética general, aclarando casos con un diagnóstico incorrecto o contradictorio o identificando nuevos mecanismos de esta enfermedad. De esta forma, pudimos demostrar que la supuesta deleción del exón 1 diagnosticada por MLPA en un caso, contradictoria con el diagnóstico de deleción del exón 1 y 2 que sugería el análisis por LR-PCR y secuenciación, en realidad era una variante estructural compleja (CxSV) que implicaba una du- plicación de los exones 2 y 3, con posterior deleción de los exones 1 y 2, la primera CxSV identificada en la deficiencia de antitrom- bina (De la Morena-Barrio B, et al., sometido). Pero el resultado más interesante implica los casos sin base molecular conocida con los métodos moleculares convencionales. El empleo de secuenciación de tercera generación nos ha permi- tido identificar la base molecular en 4 de los 14 casos analizados. En un caso, la deficiencia se debía a la deleción de gran parte del intrón 1 y a los primeros nucleótidos del exón 2 (19). Los tres casos restantes compartían la inserción de un retrotransposón de 2,4 Kb del tipo SVA-E (aunque con algunas peculiaridades que pudieron identificarse al generar el ensamblaje de novo de la se- cuencia que obtuvo con nanoporos) en el intrón 6 de SERPINC1. Este estudio es la primera descripción de que la inserción de un retrotransposón constituye la base molecular de la deficiencia de antitrombina, y amplia el número de enfermedades en las que la inserción de elementos móviles está implicada (De la More- na-Barrio B, et al., sometido). Otras fortalezas de la secuenciación de tercera generación La secuenciación de tercera generación tiene otras fortalezas que merecen destacarse. Especialmente interesante es la oportu- nidad de definir haplotipos en secuencias largas. Poder secuenciar grandes fragmentos de ADN (tanto genómico como amplicones) permite conocer el ligamiento de alteraciones genéticas y poder definir haplotipos sin necesidad de clonación o estudios familia- res. Esta aplicación se ha empleado para definir el efecto fundador de la variante p.Thr147Ala de SERPINC1 asociado con deficien- cia de antitrombina en población africana (20). La identificación de un haplotipo común formado por 14 SNV vinculados a esta mutación demuestra que la mutación tuvo una única aparición ancestral de la que derivaron todos los portadores. En este con- greso, el Dr. Teruel, de nuestro grupo, presenta una comunicación sobre el uso de esta tecnología en el diagnóstico de mutaciones bialélicas en CEBPA. Implicación de otros genes en enfermedades monogénicas. El papel de las modificaciones postraduccionales Tendemos a pensar que solo las alteraciones en el gen codifi- cante son las que pueden justificar un defecto en una proteína. Sin embargo, cada día aparecen más evidencias de otros mecanismos implicados en lo que se consideraban enfermedades monogéni- cas. Ya se conocía que deficiencias combinadas de FV y FVIII pueden ser causadas por alteraciones en proteínas implicadas en el transporte intracelular (LMAN1 y MCFD2) (21) o que la defi- ciencia combinada de proteínas vitamina K puede explicarse por alteraciones en cualquiera de los dos elementos del ciclo de la vitamina K, g -GGCX o VKORC1, con diferentes mecanismos, desde mutaciones recesivas a la disomia uniparental (22). Nuestro grupo, estudiando la base molecular de la deficiencia de antitrom- bina en casos sin alteraciones en SERPINC1, descubrió que hasta el 25 % de estos casos se deben a defectos de glicosilación con base molecular en alguno de los 25 genes implicados en la ruta de N-glicosilación (23). Es cierto que en todas estas situaciones los defectos normalmente afectan más de una proteína y podrían asociarse con más manifestaciones clínicas, pero también es cier- to que identificar la base molecular en estos pacientes abre nue- vas perspectivas terapéuticas de las que estos pacientes podrían beneficiarse (24). Nuevas patologías Aunque nos parezca mentira en el siglo xxi, con el desarro- llo de la medicina molecular, todavía quedan desórdenes cuya base molecular se desconoce. Es el caso de la agenesia de cava, una malformación congénita que se había relacionado con even- tos trombóticos durante el desarrollo embrionario (25). La iden- tificación casi casual de agenesia de vena cava en un caso con trombosis juvenil y deficiencia de antitrombina causada por una de las trombofilias congénitas más graves, la variante Budapest 3 (p.Leu131Phe) en homocigosis, que se asocia con trombosis neonatal o infantil (26), nos llevó a plantear si esta trombofilia tan grave podría asociarse con este defecto vascular. El estudio de más de mil sujetos con deficiencia congénita de antitrom- bina de dos cohortes (española y húngara) nos permitió reclu- tar la serie más grande de homocigotos Budapest 3 (n = 59). Las pruebas de imagen realizadas en 22 casos nos permitieron identificar atresia del sistema de la vena cava en 15 casos (14 en la cava y 1 en la ilíaca), todos con mecanismos vasculares compensatorios (dilatación de ácigos y hemiácigos, principal- mente), lo que nos lleva a plantear que las trombofilias graves pueden ser la base molecular que cause la agenesia de cava al favorecer el desarrollo de un evento trombótico en esa localiza- ción durante el desarrollo embrionario (De la Morena-Barrio, et al., sometido).