XXXVI Congreso SETH

Ponencias 11 de vista molecular, y ya en el lado de la trombosis, el ejemplo más interesante (del que estamos seguros que no será el último) es el potente efecto protector que la deficiencia congénita de FXI, a la que se había denominado hemofilia C, tiene en frente a la patología trombótica, especialmente en territorio venoso. La pro- tección antitrombótica observada en pacientes con deficiencia de FXI (10), junto a los datos de diferentes modelos animales, ha propiciado el desarrollo de nuevos tratamientos anticoagulantes basados en la reducción de niveles de FXI (y FXII) debido al bajo riesgo hemorrágico asociado (11,12). Enfermedades monogénicas Este ámbito se ha visto significativamente implementado con el desarrollo de la NGS. Varios grupos de nuestras sociedades es- tán produciendo excelentes resultados identificando nuevos genes y variantes génicas con distintos mecanismos implicados en dis- tintas enfermedades monogénicas de la hemostasia. Destacamos la contribución del Dr. Rivera y del Dr. Bastida en Murcia y Sala- manca, respectivamente, en el campo de las trombopatías (13); la del Dr. Vidal, en Barcelona, en la enfermedad Von Willebrand y otras coagulopatías (14) y la del Dr. Soria, también en Barcelona, por su experiencia en GWAS (15). Este campo, al igual que ocu- rre con cualquier otra enfermedad en la que se emplean sistemas de secuenciación masiva para identificar la base molecular, las variantes identificadas deben validarse para confirmar su efecto funcional y patológico. Por ello, además de una segregación fa- miliar, en muchos casos hay que recurrir a modelos celulares y animales para confirmar que sea la alteración responsable de la enfermedad. Sin embargo, existen algunos aspectos relacionados con el diagnóstico molecular de enfermedades monogénicas que las técni- cas de NGS no consiguen aclarar y que detallamos a continuación. Variantes estructurales Las variantes estructurales (SV) son alteraciones genéticas de más de 50 pb. Aunque sean mucho menos abundantes numé- ricamente en el genoma que las variantes puntuales (SNV), el hecho de que afecten a mucha más cantidad de bases hace que el potencial patogénico de las SV sea mucho mayor que el de los SNV (16). Desgraciadamente, las SV son de difícil diagnóstico empleando sistemas de secuenciación masiva basados en lectu- ras cortas, y aunque hay sistemas tanto dirigidos a genes espe- cíficos como a los que abarcan el genoma completo, capaces de detectar las SV, es cierto que algunos tipos de SV (por ejemplo, inversiones o inserciones de retrotrasposones), y especialmente algunas localizaciones, como intrónicas o reguladoras, son muy difíciles de detectar o no se caracterizan a nivel de secuencia con muchos de los métodos moleculares empleados rutinariamente (17) (Tabla I). Nuestro grupo ha desarrollado un proyecto que ha inves- tigado las SV implicadas en la deficiencia de antitrombina, la trombofilia más grave. Para ello, hemos comparado diferentes metodologías moleculares empleadas en identificar estas altera- ciones, desde MLPA a array de hibridación genómica comparada (CGHa) o PCR largas y posterior secuenciación, y, sobre todo, hemos empleado sistemas de secuenciación de tercera generación con nanoporos, que permiten un estudio del genoma completo sin ninguna manipulación generando secuencias extralargas (de hasta 2,5 Mb) (18). El estudio se ha realizado en dos cohortes. Por una parte, ca- sos con deficiencia de este anticoagulante que tenían una SV que afectaba a SERPINC1, el gen que codifica antitrombina, identi- ficada mediante MLPA, y, por otra parte, casos en los que ni la secuenciación (NGS o Sanger) ni el MLPA identificaron altera- Tabla I. Métodos diagnósticos capaces de identificar variantes estructurales Método Transl Inv CNV (> 50 Kb) Indel (1-50 Kb) SV < 1 Kb Sec punto ruptura Análisis genoma Cariotipo Sí (> 3 Mb) Sí (> 3 Mb) Sí (> 3 Mb) No No No aCGH No No Sí (> 5 Kb) No No No aSNP No No Sí Sí Sí (SNP) No Sec PE Sí Sí Sí Sí No Sí Sec Nanoporo Sí Sí Sí Sí Sí Sí Análisis dirigido MLPA No No No Sí Sí No RT-qPCR No No No Sí Sí No FISH Sí Sí Sí Sí Sí No Trans: translocación; Inv: inversión; CNV: Copy Number Variation; SV: Structural Variant; Sec: secuenciación; aCGH: Array Comparative Genome Hybridization; aSNP: array Single Nucleotide Polymorphism; Sec PE: secuenciación paired-end; MLPA: Multiple Ligation Probe Amplification; RT-qPCR: Real Time quantitative PCR; FISH: Fluorescence in situ Hybridization; Mb: Megabase; Kb: Kilobase.