XXXVI Congreso SETH

XXXVI Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 124 nulos a y d (CD62P, CD63); la activación de la integrina a IIb ß 3 (JON/A, fibrinógeno); y agregación plaquetaria (CD9). Se em- pleó microscopía confocal para evaluar la adhesión, capacidad de spreading , y niveles de fosforilación de PKC. Agonistas utiliza- dos: trombina (0,1-1U/mL), PMA (3µM) y ADP (30µM). Resultados: Los ratones RUNX1 L43S/L43S y RUNX1 WT/L43S pre- sentaron una menor secreción de los gránulos a, sin diferencias en la liberación de los gránulos d. Los niveles de activación de la integrina a IIb ß 3 , la unión del fibrinógeno y la agregación pla- quetaria fueron significativamente más bajos en las plaquetas de RUNX1 L43S/L43S y RUNX1 WT/L43S que en RUNX1 WT/WT , tras la estimulación con los agonistas PMA, ADP y altas dosis de trom- bina. Sin embargo, no se encontraron diferencias en la agrega- ción empleando bajas dosis de trombina y CaCl 2 2mM. Estos resultados sugieren una alteración en la segunda ola de activación por trombina, dependiente de PKC, sin afectación de la primera ola de activación plaquetaria por trombina dependiente de cal- cio. Los niveles disminuidos de fosfo-PKC tras la activación con trombina 1U/mL y, principalmente, con PMA, en RUNX1 L43S/L43S y RUNX1 WT/L43S frente a RUNX1 WT/WT (7,15 ± 0,9 y 7,07 ± 0,65 frente a 12,29 ± 0,48; p < 0,001 y p < 0,001, respectivamente) confirmaron la alteración funcional en PKC. Por último, no se detectaron diferencias en la capacidad de adhesión plaquetaria entre ratones de los tres genotipos. Sin embargo, las plaquetas de los ratones RUNX1 L43S/L43S y RUNX1 WT/L43S presentaron una dis- minución de la capacidad de spreading tras 15 y 30 minutos de estímulo con trombina respecto a plaquetas control. Conclusión: Demostramos la viabilidad y utilidad de generar un modelo de ratón para evaluar la patogenicidad de variantes germinales en RUNX1 identificadas en humanos. La disfunción plaquetaria causada por la variante p.Leu56Ser en RUNX1 se re- laciona con hipo-activación de la integrina a IIb ß 3 , y una alteración funcional en la vía de señalización mediada por PKC. Ellos se refleja en un defecto de agregación, secreción de gránulos a y spreading plaquetario. Los autores declaran no tener conflicto de intereses. Financiación: ISCIII-Feder PI17/01311 & PI17/01966, GRS 2061A/19, GRS 1647/A/17, IBSAL IBY17/00006, FMM AP172142019, SETH-FETH Premio López Borrasca 2019, Beca predoctoral JCyL, F.Séneca 19873/GERM/15, GT-Patología He- morrágica-SETH. CO-233 Primera demostración de herencia autosómica recesiva en trombocitopenia relacionada con ß1-tubulina. Ampliación del espectro genético que afecta a TUBB1 Palma-Barqueros V 1 , Bury L 2 , Bohdan N 1 , Revilla N 1 , Padilla J 1 , Kunissima S 3 , Rodríguez-Alén A 4 , Fernández-Pérez MP 1 , Marín-Quiles A 5 , Benito R 5 , López-Fernández MF 6 , Marcellini S, Vicente V 1 , Gresele P 2 , Bastida JM, Rivera J 7 1 Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB- Arrixaca. CIBERER-U765. Murcia, España. 2 Department of Medicine. University of Perugia. Perugia, Italia. 3 Department of Medical Technology. Gifu University of Medical Science. Seki, Japón. 4 Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Virgen de la Salud. Complejo Hospitalario de Toledo. Toledo, España. 5 IBSAL. IBMCC. Universidad de Salamanca. CSIC. Centro de Investigación del Cáncer (CIC). Salamanca. 6 Servicio de Hematología y Hemoterapia. Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña. A Coruña, España. 7 Servicio de Hematología. Hospital General de Segovia. Segovia, España. 7 Departamento de Hematología. IBSAL. Hospital Universitario de Salamanca. Salamanca, España Introducción: La tubulina-ß1 forma los microtúbulos, que son cruciales en la generación de proplaquetas. La macrotrom- bocitopenia congénita (MTC) asociada a alteraciones en el gen de tubulina-ß1 ( TUBB1 -RT), es una de las más frecuentes MTC, generalmente asintomática y es considerada, hasta la fecha, de herencia autosómica dominante (AD). El diagnóstico correcto de TUBB1 -RT exige la identificación de una alteración genética en TUBB1 , así como demostrar su patogenicidad. Objetivo: Caracterización molecular de 9 familias no rela- cionadas con MCT y demostración de la patogenicidad de las variantes encontradas. Métodos: Nueve familias con MCT (60-150 × 109/L; MPV 12.4-15.0 fL) crónica de causa desconocida fueron incluidas en el proyecto multicéntrico nacional de “Caracterización funcional y molecular de pacientes con trastorno plaquetario congénitos” (Fig. 1). El análisis molecular se realizó mediante HTS-panel de genes (plataformas MiSeq Illumina e Ion Torrent PGM) en los probandos y con Sanger para la segregación familiar. El fenoti- pado plaquetario incluyó (no en todos los casos): hemograma y frotis; agregación plaquetaria (LTA), activación por citometría de flujo, valoración tubulina-ß1 en plaquetas resting/spreading por inmunofluorescencia; ultraestructura plaquetaria por microscopia electrónica (ME). Para valorar la patogenicidad de las variantes de TUBB1 , evaluamos in vitro la formación de proplaquetas en megacariocitos (Mks) diferenciados de CD34+ de sangre perifé- rica de los pacientes, y usamos un modelo celular CHO transfec- tado con vectores WT o mutantes de tubulina-ß1. Resultados: En 6 familias (Fig. 1A) (Fam A-F) identifica- mos 4 variantes heterocigotas raras en TUBB1 con herencia AD: c.1267C>T [p.Gln423*], c.35del [p.Cys12Leufs12*], c.319A>C [p.Thr107Pro] y c.806G>A [p.Gly269Asp] (80 % penetrancia para p.Gly269Asp). El modelo CHO demostró que los mutan- tes de b1-tubulina Asp269 y Pro107 no se incorporaban en los microtúbulos (Fig. 1B). En los propositus de las familias H e I (Fig. 2) identificamos la variante de TUBB1 c.1075C>T [p.Arg- 359Trp], relativamente común (MAF˜0.01). Su papel en la MCT es incierto porque si bien altera la tubulina-ß1 en plaquetas, la formación de proplaquetas y, moderadamente la incorporación de tubulina-ß1 en microtúbulos de CHO transfectadas, no se ob- serva segregación con la MCT en estas familias (Fig. 2). En la fa- milia G, los 2 hermanos con MTC eran portadores homocigotos (HOM) de la variante nueva c.326G>A [p.Gly109Glu], mientras que 5 portadores heterocigotos tenían plaquetas normales (Fig. 1A). En Mks y plaquetas de HOM y en el modelo de CHO la tubulina-ß1 forma agregados en el citoplasma (Figs. 3A-D). Ade- más, solo los HOM mostraron una alteración de la morfología/ ultraestructura plaquetaria y un defecto en la formación de pro- plaquetas (HOM: < 5 %; control: 15 %Mks formando proplaque- tas) (Figs. 3E y 3F).