XXXVI Congreso SETH

Comunicaciones Orales 135 posones en SERPINC1 empleando secuenciación de tercera ge- neración que permite analizar secuencias de hasta 2,5 Mb del genoma completo sin manipular. Métodos: Se realizó la secuenciación completa del genoma mediante nanoporos (LR-WGS) en 12 pacientes no relacionados se- leccionados de nuestra cohorte de 250 pacientes con deficiencia de antitrombina, por no tener caracterización molecular tras análisis con secuenciación de Sanger, MLPA, secuenciación completa del gen por NGS tanto de amplicones pequeños (PGM) como de Long-Ran- ge PCR (Illumina), y análisis de glicosilación. La plataforma em- pleada fue PromeTHION (ONT). La validación de la alteración en familiares y un nuevo caso no relacionado con base molecular desco- nocida se realizó mediante PCR específica y secuenciación Sanger. Resultados: Dos pacientes presentaron una inserción de un SVA de 2440pb en el intrón 6 del gen SERPINC1 no descrita en GnomAD (Fig. 1i). El ensamblaje de novo permitió conocer que la inserción del SVA tenía orientación antisentido, y estaba flanqueada por un tándem site duplication (TSD) de 14pb, ca- racterística del mecanismo de inserción de los SVA (Fig. 1ii). La comparación de la secuencia insertada con las secuencias SVA canónicas (A-F) mostró que era similar al SVA E, aunque pre- sentaba una secuencia mucho más larga del subelemento VNTR (1.449pb frente a 520pb) (Fig. 2). La validación de la inserción no fue posible empleando PCRs que flaquearan el SVA, y solo se consiguió con una PCR específica que utilizaba un oligonu- cleótido interno del SVA (diseñado tras alinear las secuencias de PromeTHION), y uno de SERPINC1 que flanquea el punto de in- serción. Esta PCR validó los resultados de nanoporo, confirmó la presencia del SVA en familiares con deficiencia de antitrombina, y permitió identificar la inserción del SVA en un caso adicional con deficiencia de antitrombina sin base molecular conocida e historia familiar (Fig. 3). Los tres casos, todos con deficiencia tipo I cuantitativa y trombosis temprana, compartían el mismo SVA, insertado en la misma posición de SERPINC1 y con la mis- ma TSD. Estos datos junto a que los tres comparten un mismo po- limorfismo intragénico de muy baja frecuencia, y la transmisión germinal, sugieren un efecto fundador. Conclusiones: El empleo de secuenciación de tercera genera- ción ha permitido no solo la detección por vez primera de la inser- ción de un SVA causante de deficiencia de antitrombina, sino que ha permitido su completa caracterización mediante ensamblaje de novo de lecturas largas genómicas. Esta variante estructural, Figura 1. Representación de los resultados obtenidos por secuenciación por nanoporos. i) Imagen de IGV en la que se muestran las secuencias obtenidas de P1 y P2 en el intrón 6 de SERPINC1 ii) Representación esquemática la estructural del elemento SVA de 2440pb insertado. Figura 2. Árbol filogenético de las familias de retrotrans- posones SVA, en el que se muestra el SVA insertado (“R SVA P9”) obtenido mediante el algoritmo Neighbour-Joi- ning (NJ). Figura 3. Representación de la validación de la inserción del retrotranspo- son en los pacientes P1-P3. A. Representación esquemática del gen SER- PINC1 con ZOOM a la región de la inserción. Los primerOs se muestran en verde y naranja usados en PCR cortas o LR-PCR, respectivamente. B. La combinación de primers usada se muestra en la tabla. Los resultados de las PCR positivas en los pacientes y familiares se muestran en los genes de agarosa. C. Pedigri de las familias con inserción de retrotransposon P1-P3.