XXXVI Congreso SETH

XXXVI Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 136 por implicar un elemento rico en regiones repetitivas que se in- serta en una región intrónica, no se detecta con ningún otro mé- todo molecular. Finalmente se trata de una alteración recurrente, identificada en tres casos de nuestra cohorte (1 %) con un efecto fundador. PI18/00598 (ISCIII&FEDER); 19873/GERM/15 (Fundación Séneca). CO-243 La antitrombina prelatente regula la vía del VEGF-A en células de glioblastoma- astrocitoma Peñas Martínez J 1 , Ródenas Bleda MC 1 , Zaragoza Huesca D 1 , Espín García S 1 , Vicente García V 1 , Martínez Martínez I 2 1 Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB-Arrixaca. Murcia. 2 Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB-Arrixaca. U-765-CIBERER. Murcia Introducción : La antitrombina, principal inhibidor de la cas- cada de la coagulación, presenta otras funciones más allá de la hemostasia. Además, la antitrombina puede presentar distintas conformaciones a nivel estructural: nativa, activada por la heparina, rota, latente y prelatente. La conformación prelatente se presentan in vivo en concentraciones muy bajas, aunque es posible aumentar su ratio in vitro al incubar la antitrombina nativa a temperaturas elevadas. Nuestro grupo ha demostrado que la antitrombina prela- tente reduce la migración e invasión de células de glioblastoma-as- trocitoma U-87 MG de forma más efectiva que la conformación activada por heparina, pero desconocemos el mecanismo por el cuál ejerce este efecto (Congreso SETH 2018; CO-167 y CO-168). Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la antitrombina prelatente en las células de glioblastoma-astroci- toma U-87MG mediante un array de expresión. Métodos: La antitrombina prelatente se purificó mediante dos pasos de cromatografía de afinidad por heparina tras calentar antitrombina de plasma humano a 60 °C durante 30 horas. Tras la incubación de antitrombina prelatente (2,16 µM) o PBS (mues- tras control) con las células U-87 MG (n = 8/grupo), se extrajo el RNA, se realizó retrotranscripción y marcaje de los cDNA resul- tantes, que se hibridaron en el Clariom D humanArray. El análisis de los resultados se realizó utilizando el software Transcriptome Analysis Console, considerando diferencias estadísticamente significativas para aquellos valores de expresión con p-value < 0,05 y fold change < -2 o > 2. También se realizó un análisis de componentes principales (PCA). La validación de las diferencias de expresión en VEGF-A se llevó a cabo mediante RT-qPCR y western blot de los lisados celulares. Para el análisis estadístico se utilizó el t-test no apareado de 2 colas. Resultados: El PCA separó las muestras control y las mues- tras tratadas con antitrombina prelatente en función de los trans- critos expresados (Fig. 1). Los genes sobreexpresados en las células tratadas con antitrombina prelatente fueron 1911 mientras que 1491 estaban infraexpresados. Entre las principales rutas que presentaban una expresión diferencial, destacamos la vía VE- GF-A. Validamos las diferencias de expresión en las células U-87 MG, observando una menor expresión de VEGF-A cuando se in- cubaban con antitrombina prelatente, tanto a nivel de proteína (n = 3/grupo; 0,489 frente a 0,265) (Fig. 2A) como de ARNm (n = 5/grupo; p < 0,0215) (Fig. 2B). Conclusiones: Nuestros resultados demuestran que la anti- trombina prelatente reduce los niveles de VEGF-A en células de glioblastoma-astrocitoma. VEGF-A muestra una actividad promi- nente sobre células endoteliales, pero también actúa sobre otras lí- neas celulares entre las que se encuentran las células neuronales y las células tumorales. En las células U-87MG, ya se ha demostrado que la reducción de la expresión deVEGF-A inhibe la proliferación, invasión y angiogénesis, de manera que el efecto antitumoral que ejerce la antitrombina prelatente sobre las células U-87 MG podría estar mediado principalmente por la inhibición de la vía VEFG-A. Financiación: PI17/00050. Figura 1. Análisis de compponentes principales (PCA) de los transcritos obtenidos de las células U-87 MG tratadas con medio de cultivo o con AT prelatente. Figura 2. Expresión de VEGF en las células U-87 MG tratadas con y sin antitrombina (AT) prelatente. A) RT-PCR del RNA extraído de las células procedentes de 5 experimentos independientes. La expresión de VEGF se relativizó a la expresión de GADPH (2-∆Ct). B) Electroforesisy western blot de los lisados celulares procedentes de 3 experimentos independientes. Como control de carga se utilizón GAPDG.